利剑出鞘|脐血中PBMC的高效分离及NK细胞的高效培养
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发表时间：2022-03-21 16:58:09
NK细胞进入临床试验已有十几年时间，但受扩增困难、诱导技术差异大、诱导效率低等因素影响，随着科学技术的发展，很多技术难题都将被攻克，有机构估测2021年全球NK细胞疗法市场销售额达到了3.5亿美元，预计2028年将达到10亿美元。
2021年11月11日，国家药品审评中心通过了一款由国健呈诺生物研发的针对“晚期上皮性卵巢癌治疗的靶向间皮素（Mesothelin，MSLN）嵌合抗原受体NK细胞（CAR-NK）注射液”的临床试验申请。这是国内首例正式审批通过的“现货型”异体来源的CAR-NK产品。近日，Fate Therapeutics宣布，美国FDA已批准其“现成”的、iPSC衍生的CAR-NK候选产品FT536的研究性新药（IND）申请。随着CAR-NK产品的喜报频传，NK细胞也逐渐成为肿瘤免疫疗法的热门候选者。
NK细胞来源非常广泛，包括外周血、脐血、诱导多能干细胞（iPSC）和NK92等细胞系。在众多样本来源中，脐血作为现成的异源性资源，具有来源广泛且无伦理问题，其所含的幼稚免疫细胞不易引发移植物抗宿主病（GVHD），同时脐血中含有的NK前体细胞多于成人外周血等特点，成为治疗性NK细胞最有前途的无创性来源。
脐带血来源的NK细胞治疗多发性骨髓瘤的II期临床试验，结果显示，79%患者获得了完全缓解或很好的部分缓解，3年无进展生存率可达52%。另有研究表明，脐带血NK细胞具有较强的体内外抗肿瘤活性，可单独应用或联合贝伐单抗用于中晚期结直肠癌的治疗。除此之外，长期冷冻保存对脐带血NK细胞的扩增潜能和抗肿瘤活性都没有影响。这也使得脐带血NK成为推进NK细胞免疫治疗领域的一个可行细胞来源。
根据研究表明，与外周血NK细胞相比，脐血NK细胞表现出相似水平的CD56、天然细胞毒性受体NCRs(NKp46和NKp30)和NKG2D，但CD16、粘附分子(如CD2、CD11a、CD18、CD62L)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIRs、DNAM-1、NKG2C、CD57和CD8(与末端NK细胞成熟相关的受体)的表达较低，且抑制受体NKG2A的表达较高，表明脐血NK细胞比外周血NK细胞具有不成熟的表型，细胞毒性降低。此外，与外周血NK细胞相比，脐血NK细胞具有更高的骨髓归巢受体CXCR4的表达，这表明脐带血NK细胞可能具有更大的归巢骨髓的潜力。
脐血NK细胞与外周血NK细胞有什么区别？
根据研究表明，脐血与成人外周血血液成分存在较大差异。首先，脐血中的白细胞数目明显高于与成人外周血，脐血里有核细胞数目更多，且富含干细胞等原始细胞成分，保证了脐血中有足够的PBMC进行诱导NK细胞。
其次，脐血中血红蛋白(HB)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)及平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)较成人外周血明显偏高，不仅如此，由于红细胞中的血红蛋白占90%，红细胞破裂会导致血红蛋白含量进一步增高，据文献显示，较高浓度的血红蛋白能抑制细胞增殖（如血管内皮细胞、骨髓瘤细胞等），因此，在分离脐血PBMC时，应考虑尽可能减少脐血中血红蛋白以及红细胞的影响。
最后，脐血中红细胞体积较大，含有较多的幼红细胞，根据血流变学测定实验显示，脐血血球压积较高，红细胞变形性较低而聚集性较高，使脐血呈高粘滞状态，红细胞沉降率显著降低，其大小不一，密度不同，很难与白细胞、血小板等分离并形成有效的细胞密度分离层。因此，如何减少脐血中红细胞的影响是脐血PBMC分离的最大难点。
如何高效分离脐血PBMC并减少红细胞的影响？
根据研究表明，直接用淋巴细胞分离液分离脐血PBMC的回收率仅有54.40％±4.52％，分离率低且分离效果差，导致无法保证有足够的PBMC用于NK细胞的诱导培养。据文献显示，使用淋巴细胞分离管或采用不同降温速率均可提高PBMC的分离效果，但这些方法在分离成本、分离操作上存在一定的局限性。
为了简单有效地分离脐带血PBMC，最大程度减少红细胞的干扰，并且保证分离的淋巴细胞生物活性。在分离脐血PBMC时，首先应使用样本预处理试剂，使样本中密度不一的大部分红细胞和幼红细胞加速沉降，其次使用样本高效分离液，使脐血中的各细胞形成有效的细胞分离层。与此同时，为了保证PBMC的生物活性，应使用细胞高效处理试剂降低样本的高粘滞状态及去除干扰物质。
如何高效诱导扩增脐血NK细胞？
目前NK细胞体外诱导扩增的技术路线主要有两种，一种是将肿瘤细胞株用作滋养层细胞来培养细胞，虽然能够大量扩增NK细胞，但添加异体细胞作为滋养层细胞，尤其是K562癌细胞株，在临床应用上也存在重大风险与伦理问题。另一种则是采用纯因子细胞培养，纯因子细胞培养技术安全性高，但由于在培养过程中需要添加不同种类不同浓度的细胞因子或抗体，操作相对繁琐且成本也难以把控。因此，如何选择在体外诱导扩增脐血NK细胞的方案显得尤为重要。
为了获得大量高纯度的脐血NK细胞以满足临床输注的应用，在脐血NK细胞培养过程中，应注意以下几点：
1.在采集脐血样本阶段，应确保使用正确适量的抗凝剂（如肝素钠抗凝剂），以保证样本的有效性。
2.在分离脐血PBMC时，应选择专用的脐血样本密度分离液，在保证脐血中PBMC的生物活性和数量充足的同时，尽量减少红细胞的残留。
3.NK细胞培养最佳起始接种细胞密度为2.0~2.5×106cells/ml。
部分参考文献：
1.马金栋. 新生儿脐血细胞的免疫状态. 中华妇产科杂志．1998；11(10)：682.
2.尹卫东，刘克芹，石万元，等．新生儿脐血细胞分类计数结果分析．张家口医学院学报，2003，20（3）：44～45．
3.马虹，马云胜. 新生儿脐血与成人外周血细胞比较分析. 数理医药学杂志，2007，20（2）：246.
4.路春霞，魏本杰，舒畅，杨丽丽，左红斌.脐血单个核细胞分离方法的比较研究.临床血液学杂志,2016,29（7）：593.
5.姜胜华，丁润生.脐带血血液流变学测定及其临床意义.交通医学，1999，13（1）：21.
6.李德生，邱海霞，许百男，段炼.氧合血红蛋白对脑微血管内皮细胞增殖和凋亡的影响.临床神经外科杂志，2008，5（2）：73.
7.张校通，王翔，申重阳等.一种简便提取脐带血单个核细胞的方法.中华临床医师杂志：电子版，2013，7（13）：5998-6000.
8.Sarvaria A，Jawdat D，Madrigal JA，et al． Umbilicalcord blood nat-ural killer cells，their characteristics，and potential clinical appli-cations． Front Immunol，2017，8:329．
9.Prabhu SB，Rathore DK，Nair D，et al． Comparison of human neonatal and adult blood leukocyte subset composition phenotypes．PLoS One，2016，11(9):e0162242．
10. Hoogstad-van Evert J，Bekkers R，Ottevanger N，et al． Intraperitoneal infusion of ex vivo-cultured allogeneic NK cells in recurrent ovarian carcinoma patients ( a phase I study)． Medicine ( Baltimore)，2019，98(5):e14290．
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