单个核细胞分离小技巧

外周血单个核细胞（PBMC）和脐带血单个核细胞（CBMC）都是细胞免疫治疗研究中最常用的细胞来源 , 主要由几类免疫细胞组成，包括T细胞 (约占70%)、B细胞 (约占15%)、单核细胞 (约占5%)、树突状细胞 (约占1%) 和自然杀伤NK细胞 (约占10%)。这些细胞是先天免疫和适应性免疫系统的关键组成部分, 在保护身体免受病毒、细菌和寄生虫的感染的同时可以消灭异常细胞，衰老细胞以及肿瘤细胞。因此其在免疫治疗、细胞治疗、传染治疗、肿瘤治疗、癌症治疗等领域被视为宝贵资源。

单个核细胞的分离方法

• 密度梯度离心（Ficoll）法进行分离
  

单个核细胞的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同，红细胞和多核白细胞的比重在1.092左右，单个核细胞的比重为1.075-1.090，血小板为1.030-1.035。因此利用一种介于1.075-1.092之间而近于等渗的溶液（密度梯度分离液或分层液）作密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，可将各种血细胞与单个核细胞分离。

• 磁珠法
  

磁珠法是一种利用磁性珠子分离单个核细胞的方法。首先将磁性珠子与特定的抗体结合，使其具有特异性；然后将细胞悬液与磁性珠子混合，使其结合到目标细胞表面；接着用磁力将带有目标细胞的磁性珠子沉淀到离心管底部，最后用DPBS洗涤将单个核细胞分离出来。

• 流式细胞术
  

流式细胞术是一种利用细胞表面标记分离单个核细胞的方法。首先将细胞悬液与特定的荧光标记抗体混合，使其结合到目标细胞表面；然后将细胞悬液通过流式细胞仪，利用荧光信号和细胞大小等特征，将单个核细胞分离出来。

由于流式细胞仪法对细胞损伤较大，免疫磁珠法价格相对较贵，其应用均受到限制。而密度梯度离心法简单快速，分离成本低，分离后的细胞活力高，目前主流的分离方法是采用密度梯度离心（Ficoll）法进行分离，制备好的PBMC样本可立即使用，也可进行冷冻保存。

听起来似乎很简单，但在实验中可能会遇到各种复杂的情况。今天我们就来具体聊一聊如何从全血、脐带血中有效地分离出PBMC单个核细胞。

01.外周血/单个核细胞分离操作步骤

Tips:依据血液样本量不同，需选择不同直径的离心管，以保证分离体系适宜。初次摸索可以参考下面的实验体系，每10ml外周血可分离的PBMC约为：1x107cell（仅供参考）

实验步骤

1. 将血液采集至肝素钠采血管；

Tips：培养免疫细胞推荐使用γ射线灭菌的NIPRO肝素钠采血管（货号：NP-NH0507Gr），其他抗凝剂会影响细胞后续培养增殖。

2. 在两支装有 15ml 淋巴细胞分离液的离心管上，分别小心地倒上 20～30ml 血液；

Tips：血液应缓慢加至淋巴细胞分离液上层，且要注意保持界面清晰。

3.室温下，800xg 离心 20min，慢升慢降，若血液储存超过 2小时，请将离心时间增至 30min；

Tips：国产离心机升1降0，进口离心机升3降2，具体可根据离心机情况进行微调，建议选用性能稳定，缓升缓降的品牌离心机。

4.离心后，血液被分为 4 层，由血浆层、单个核细胞层、分离液层和红细胞层构成；

5. 将第一层血浆层收集进行灭活；

Tips：建议使用恒温自动加热仪（货号：BX5101）灭活，避免水浴造成污染。

6. 用移液管将第二层单个核细胞收集至新的离心管；

Tips：如果仅收集第二层，清洗两遍即可；为最大程度收集单个核细胞，建议收集第二层和第三层，尽量避免吸到红细胞层， 而后清洗3遍；

7. 加入 DPBS 35ml 稀释细胞悬液，500xg 离心 10min；

Tips：PBMC分离后洗涤应选用DPBS（货号：CS001），DPBS不含 Ca2+、Mg2+，可避免细胞结团，维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定，供细胞和组织一个相对稳定的离子环境； 

8. 移除上清液，重复第2步骤洗涤细胞3次，最后一次混匀后取100ul悬液细胞计数，余下悬液500xg离心10min；

9. 分离后的PBMC就可以进行后续诱导培养。

特殊血液标本分离培养的注意事项：

1、应避免使用溶血标本，释放的血红蛋白会影响细胞的增殖效果；

2、胆红素升高的外周血，应首先分离血浆，并稀释洗涤外周血，再进行分离PBMC；

3、脂血标本应洗涤后再进行分离，且分离的血浆，灭活后进行细胞培养可能会导致细胞贴壁严重，建议使用血替替代使用；

4、肿瘤放化疗患者分离的PBMC可能偏少，分离的血浆存在药物残留，质量下降，可使用血替替代；并选用专用NK高效诱导培养试剂盒（货号：T20153P3），提高NK细胞纯度和杀瘤活性；

5、选择质量稳定的样本密度分离液，降低可能对血液分离产生的影响。

脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液，不仅含有丰富的造血干细胞、间充质干细胞，还含有丰富的免疫细胞，如T细胞、NK细胞等。脐血作为现成的异源性资源，来源广泛且无伦理问题，其所含的幼稚免疫细胞不易引发移植物抗宿主病（GVHD），是目前治疗糖尿病、肝硬化、血液病等疾病的干细胞主要来源，目前已用于临床研究或临床应用。

根据文献报道，新生儿脐血细胞与成人静脉血细胞相比白细胞（WBC）数目差异性十分显著，表明脐血里有核细胞数目多。脐血中血红蛋白（HGB）、平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白含量（MCH）及平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）较成人外周血高，表明脐血中红细胞体积较大，同时也说明脐血细胞里有较多的幼红细胞，其密度和白细胞十分接近。由于红细胞过多可能影响细胞增殖，在分离脐血单个核细胞时，应考虑尽可能减少脐血中血红蛋白以及红细胞的影响。因此，如何减少脐血中红细胞的影响是脐血CBMC分离的最大难点。

为了简单有效地分离脐带血CBMC，最大程度减少红细胞的干扰，并且保证分离的淋巴细胞生物活性。在分离脐血CBMC时，应使用高效样本密度分离液（货号：CS006），使脐血中的各细胞形成有效的细胞分离层，降低样本的高粘滞状态及去除干扰物质。

02.脐血/单个核细胞分离操作步骤

1.血液分离

Tips：

①推荐使用肝素钠/枸橼酸钠的采血管或含有保存液Ⅲ的采血袋采集脐带血，其他抗凝剂对本方案有一定影响；

②使用采血袋采集脐血时，推荐使用 100ml 规格的采血袋，若脐血采集量过少将导致抗凝剂过剩，血浆内抗凝剂过剩将影响细胞培养效果；采血量（含抗凝剂）少于50ml时，不建议用于免疫细胞诱导培养。

（1）分离血浆：室温下，500xg离心10min，取上层血浆，灭活备用；剩余血液成分，加 solutionⅢ补至原体积，记为 A 液；

Tips：离心升降速为升5降5，如果血样放置时间过长血浆分离效果不理想，可适当延长离心时间。

（2）沉降红细胞：将 A 液按 2:1 比例加入至 solution Ⅰ中，充分混匀，50 xg 离心 10min；取上清，记为 B 液；

（3）分离 PBMC：solution Ⅱ:B 液按 1:1~1:1.5 比例，将 B 液缓慢加入 solution Ⅱ上，室温下 800xg、缓升缓降、离心 20min，若血液储存超过 2 小时，请将离心时间增至 30min。

2.制备CBMC

（1）离心后，使用移液管将白膜层单个核细胞收集至新的离心管；

（2）加入50ml solution Ⅲ稀释细胞悬液，500xg离心 10min；

（3）移除上清液，加入50ml solution Ⅲ重悬细胞悬液，混匀，500xg离心10min；重复此步骤，取100ul悬液细胞计数，余下悬液500xg离心10min，去掉上清即可获得脐带血单个核细胞

Tips：处理脐血样本时应尽量提高 PBMC 纯度，减少红细胞干扰，红细胞过多会影响 NK 细胞的诱导扩增。

TIPS 外周血采集及其他注意事项

• 使用新鲜外周血和脐血标本, 避免溶血、冷冻等情况，保证PBMC/CBMC的活性；
  
• 严格筛选脐血来源及传染源的检测，并具有可溯源性，建立质量控制标准和体系；
  
• 样本密度分离液启封后宜4℃避光保存, 使用前需提前拿出，待恢复至室温后再使用；
  
• 所有试剂应符合体外诊断试剂要求，所有耗材应无菌、内毒素合格。
  

单个核细胞分离是免疫学研究中的一项基本技术，看似简单却暗藏细节。总得来说，细胞分离和培养是个细致活，保持耐心，掌握多方面实验小技巧，让细胞培养少一些提心吊胆，多一份安心！