在生命科学及医学领域，细胞培养是技术人员必须掌握的一门实验技能。可是，想要培养一窝健康成长的细胞“宝宝”并不容易，花了时间花了心力却还时不时的来个污染，尤其是微生物污染，轻则污染培养箱，重则细胞废弃，甚至培养室工作暂停！

只要是混入细胞的培养环境中对细胞生存有害的成分以及造成我们细胞培养不纯的异物都应该被视作污染。当细胞出现如下情况：①细胞不增殖或增殖较为缓慢②培养液颜色发生明显变化③培养液发生浑浊或出现大量絮状物④镜下观察细胞大量黑色颗粒。我们应及时排查是否存在污染。

常见微生物污染分类

01.细菌污染

细胞中的细菌污染，最常见的有葡萄球菌等革兰阳性菌以及大肠杆菌、假单孢菌、枯草杆菌等革兰阴性菌，其中芽孢杆菌、葡萄球菌是细菌污染的主要菌属。细胞受细菌污染后，会很快出现培养液混浊，pH发生改变。也有少数培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染。所以，每天应仔细观察并进行显微镜菌检。

细菌污染后显微镜下观察呈现有黑色细条沙状，当然，根据污染的细菌不同，所呈现的状态也不尽相同，有球形、杆状等，其次，培养液发黄，变浑浊，可明显看见培养皿中有细沙状的沉淀物，时不时还有异样气味发出。

从左到右依次为：细胞袋内污染、细菌污染、芽孢杆菌、革兰阳性杆菌

02.真菌污染

真菌污染在炎热潮湿的季节时常发生，污染的多是曲霉菌，白色念珠菌，酵母菌，黑霉菌，孢子菌等。霉菌污染后多数在培养液中形成淡黄色或是白色的漂浮物，一般肉眼可见，较易被发现，短期内培养液多不变混浊。

倒置显微镜下可以看见细胞之间有纵横交错穿行的丝状，树枝状或管状菌丝，并漂浮在培养液中。很多菌丝在高倍镜下可以看见链状排列的菌株。念珠菌及酵母菌菌株呈卵圆形，散在细胞上及细胞周边生长。

                                                                                   白色念球菌污染

03.支原体污染

支原体是一类无细胞壁、大小介于细菌和病毒之间（直径在0.13-0.18um）并独立生活的微生物，因此常规的无菌过滤（0.22um）方法不能将其去除。支原体污染多属于外源性污染，也有内源性的，感染力高且不易被检测，在大规模细胞培养中极为常见。支原体污染细胞后，生长缓慢，早期很难发现，显微镜下常可见到细胞核及胞浆内出现大小不等的颗粒或空泡，短期内培养液不变浑浊。

04.黑胶虫污染

黑胶虫污染在细胞培养中常见，又称“纳米细菌”污染，与细胞呈现此消彼长的现象，即刚开始对细胞无明显影响，随着数量的增多可影响细胞甚至使细胞死亡。黑胶虫可穿透滤膜并可通过空气传播。低倍镜下呈黑色点状或片状，高倍镜下可观察到黑色小虫游来游去。受黑胶虫污染的细胞培养液不浑浊，颜色、透明度无明显变化。

05.非同种细胞污染

一般来自细胞建株和细胞传代过程中两种或两种以上细胞之间的混合污染。在细胞培养的过程中，细胞种类不同，其理化特性、培养操作模式也不尽相同，若在同一无菌环境区域操作，所用试验材料极易导致不同种细胞间交叉污染。

逢污必“亮剑”之处理方法

对于确定污染的细胞最好的办法就是及时丢弃，积极排查细胞污染的原因。

细胞生产的5M1E——细胞污染的预防

1、人员

人是细胞培养过程中重要的污染源。技术人员需要进行上岗前的培训，考核合格后才能上岗工作。技术人员应有较强的无菌意识，进入洁净车间时进行手部消毒，更换无菌洁净服，穿戴一次性口罩及帽子，如果是女性人员需将头发扎于脑后，进入超净台前应用75%酒精对双手及手腕进行全面消毒，确保除菌完全。技术人员需每年体检检测传染四项，确保自己传染四项结果阴性，且乙肝表面抗体阳性。

2、设备

培养箱——细胞污染一个主要的途径。应1-2个月对培养箱定期进行清洁消毒。先用75%酒精擦拭培养箱内壁、隔板、水盘2-3次，用双蒸水清洗，再用酒精棉球擦拭一遍，最后紫外灯照射1h以上或进行高温灭菌处理。水盘内加入无菌水应每周更换，待培养箱内温度、湿度、CO2浓度稳定后再放入细胞。细胞培养瓶或培养皿，如果接触了操作台以外的地方，在放入培养箱前须经消毒酒精擦拭。但须注意的是，消毒酒精要经操作台吹干，否则会导致培养箱内乙醇浓度升高，酒精会影响细胞的正常功能。一旦发现培养物被污染，立马清走。 

水浴锅——适宜的温度和生长环境使水浴锅成为了细胞实验室中各种污染源的温床，水浴锅平时需要保持干燥，使用时添加无菌水，使用后及时清洁水浴锅。相较而言，推荐使用BC-18恒温自动加热仪，加热仪可提供无污染的温控条件且更易清洁，使用也更加省心。

除此以外，每次实验结束后需要用75%酒精对实验室内的仪器设备进行清洁消毒。

3、试剂、耗材

3.1 一次性耗材的选择：尽量选用一次性无菌耗材，需要重复使用的耗材确保按照规定清洗、高温高压灭菌，使用灭菌指示带，无内毒素。灭菌后烘干的耗材立刻放进超净台，一周内使用完毕，未使用完的，需重新灭菌再使用。

3.2 采血：在进行免疫细胞培养时，还需要注意样本采集时的无菌操作，如果细胞在培养前期发生污染，应排除采血管内是否本身携带有菌，医院内部及大部分销售的采血管采用环氧乙烷灭菌，可能存在灭菌不完全的风险，建议选择γ射线灭菌的采血管。

3.3 免疫细胞扩大培养时，建议使用大容量NIPRO培养袋取代培养瓶，减少开瓶次数，避免污染。

除此以外，培养时所需的试剂应专人专用，像血替、白蛋白之类的试剂应在开封时进行分装保存，分装量应保证一次使用量。

4、操作规程

实验室负责人应根据实际情况，制定修改各项操作程序及规章制度及人员培训计划，实验过程中建立和严格执行标准无菌操作流程。细胞培养中无菌操作需要符合GMP要求清洁的工作环境、实验的合理安排、实验者熟练的操作技巧及强烈的责任感。细胞培养中发生污染是不可避免的，我们的目的是尽可能减少污染的发生及危害。

5、生产环境

在南方气候潮湿容易滋生霉菌，为保证实验室的湿度在合适的范围（45%-65%），应备有抽湿机。洁净区内要求每周对环境进行打扫及消毒：84消毒液和新洁尔灭交替使用清洁顶棚、墙面及地面，紫外灯及臭氧对洁净区环境进行整体消毒，不同等级的洁净室以及洁净区与非洁净区之间的压差,应不小于5 Pa，洁净区与室外的压差,应不小于10 Pa。洁净区定期进行维护和保养，更换初、中、高效过滤器及生物安全柜的性能检测。

6、预防

细胞污染后想要挽回比较困难，因此预防就尤为重要，可在培养液中添加抗生素，如双抗（青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL）、庆大霉素（50μg/mL）等，也可使用支原体预防试剂预防支原体的污染发生。虽然抗生素能够起到一定的预防效果，但使用不当也会对细胞生长造成影响，所以不能对抗生素过分依赖，不建议使用含抗生素的无血清培养液及试剂。

7、检测

定期的检测是检验洁净区环境维护情况的判断依据，应每月进行一次洁净区的沉降菌、浮游菌、尘埃粒子、空调风速风量的检测，确保环境洁净度符合要求。

细胞也需进行相应的检测，如无菌、真菌、内毒素、支原体及流式检测，结果合格后方可使用。

参考文献

01.安芳兰，张荣，武发菊，等.大规模细胞培养过程中污 染的类型及控制策略探讨［J］.甘肃畜牧兽医，2016， 46（19）：27-30.

02.苟东东.浅谈细胞规模化培养过程中引起污染的类型及防治策略探讨[J].科技与创新,2018(12):39-41.

03.李雨婷，吕美红，等.细胞污染及预防.微生物前沿，2023（1）：26-32.